在著手購買 DNA 引物之前,精準(zhǔn)明確引物序列是關(guān)鍵步驟。通常情況下,優(yōu)先參考已發(fā)表的高水準(zhǔn)學(xué)術(shù)論文中所記載的引物信息,這些引物往往經(jīng)過了一定的實(shí)踐驗證。然而,并非所有引物都能在文獻(xiàn)中覓得蹤跡,而且有時即便文獻(xiàn)有所提及,其引物序列在實(shí)際應(yīng)用中,也未必能完全契合我們的實(shí)驗預(yù)期效果。鑒于此,自行設(shè)計引物序列,或是向?qū)I(yè)生物公司提供目的基因名稱,委托其幫忙設(shè)計并合成引物,便成了可行之舉。
我司供應(yīng)的引物,一般是以凍干粉的形態(tài)發(fā)貨。這種形式的引物具備良好的穩(wěn)定性,不僅便于運(yùn)輸,在存儲保管方面也優(yōu)勢顯著。同時,鑒于不同實(shí)驗者對引物濃度以及具體實(shí)驗用途有著多樣化需求,凍干粉引物還支持自定義溶解,靈活性頗高。值得注意的是,凍干后的引物質(zhì)地輕盈,且含量極少,剛收到貨時,若不仔細(xì)端詳,甚至很難察覺引物管內(nèi)已然裝有物品。
當(dāng)客戶順利收到 DNA 引物后,可依照如下步驟規(guī)范使用:
- 引物準(zhǔn)備:
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- 仔細(xì)核驗引物的包裝完整性以及標(biāo)簽信息,務(wù)必保證所收到的引物準(zhǔn)確無誤,不存在任何差錯,且未超出有效期。
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- 在開啟引物管瓶蓋進(jìn)行溶解操作前,千萬要記得將引物管置于離心機(jī)內(nèi),以 3000 - 4000 轉(zhuǎn) / 分的轉(zhuǎn)速離心 1 分鐘。如此操作,能夠讓引物粉末有效聚集到管底,避免開蓋瞬間引物四處飄散造成損失。隨后,依據(jù)引物說明書給出的推薦濃度,選用適配的溶劑(常見的如雙蒸水或 TE 緩沖液)來溶解引物。一般而言,引物的儲存液(即母液)濃度通常設(shè)定為 100μM(這里 μM 等同于 μmol/L,M = mol/L,換算下來 1μM = 1pmol/μL),而工作液濃度大多為 10μM。
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- 需將引物溶液輕柔地上下振蕩,使之充分混勻溶解,接著再進(jìn)行短暫離心,確保貼附在管壁上的溶液也能一并收集起來。
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- 倘若合成的引物 OD 數(shù)偏高,為減少反復(fù)凍融對引物質(zhì)量的潛在影響,建議將引物溶液分裝成若干小份。
- 最后,把分裝好的引物妥善存放于 - 20℃甚至更低溫度的冰箱環(huán)境中,以維持其活性與穩(wěn)定性。
- PCR 反應(yīng)準(zhǔn)備:
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- 結(jié)合 PCR 實(shí)驗的具體目標(biāo)與要求,精心籌備 PCR 反應(yīng)體系。這一體系涵蓋了 DNA 模板、PCR 緩沖液、dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)以及至關(guān)重要的引物。
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- 嚴(yán)格參照引物的推薦濃度,向 PCR 反應(yīng)體系中精準(zhǔn)加入適量的引物,確保用量恰到好處。
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- 對 PCR 反應(yīng)體系內(nèi)各組分的濃度與比例進(jìn)行細(xì)致核對,保證其完全符合 PCR 反應(yīng)的嚴(yán)苛要求,任何細(xì)微偏差都可能影響實(shí)驗結(jié)果。
- PCR 反應(yīng)設(shè)置:
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- 依照實(shí)驗規(guī)劃,合理設(shè)置 PCR 儀的反應(yīng)程序,包含預(yù)變性、變性、退火、延伸等一系列關(guān)鍵步驟。
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- 充分考量引物自身特性(如退火溫度),針對性地對 PCR 反應(yīng)程序中的退火溫度與時間進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整,確保引物能在最佳條件下發(fā)揮效能。
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- 完成上述步驟后,正式進(jìn)行 PCR 反應(yīng),并在過程中密切留意反應(yīng)進(jìn)程,隨時準(zhǔn)備應(yīng)對可能出現(xiàn)的異常情況。
- PCR 產(chǎn)物分析:
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- 在 PCR 反應(yīng)結(jié)束后,可以通過凝膠電泳等常規(guī)方法對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析,通過電泳條帶的呈現(xiàn),初步判斷產(chǎn)物的質(zhì)量與純度等關(guān)鍵指標(biāo)。
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- 依據(jù)后續(xù)實(shí)驗的深入需求,還能夠?qū)?PCR 產(chǎn)物采取進(jìn)一步的精細(xì)處理,例如進(jìn)行克隆操作以實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增,或是送去測序獲取精準(zhǔn)的基因序列信息等。
特別提醒,在使用 DNA 引物的全過程中,務(wù)必要嚴(yán)格遵循引物附帶的使用說明,以及 PCR 反應(yīng)既定的實(shí)驗條件,以收獲理想的實(shí)驗成果。與此同時,在實(shí)驗操作期間,必須嚴(yán)格遵守實(shí)驗室的各項安全規(guī)定,全方位保障實(shí)驗安全、有序推進(jìn)。